Vérification de pipettes à piston par méthode photométrique ratiométrique à deux colorants

1. Instructions pour des volumes essais (V_U) de 2 à 10 µL

Les instructions qui suivent sont une adaptation de la norme ISO8655-7 et du rapport ISO/TR 16153. La norme propose un exemple avec des cuves photométriques autorisant un volume de diluant (V_D) à 5 mL dans lequel le volume essai V_U est introduit. Je propose un mode opératoire pour cuves standard en plastique avec un volume de diluant (V_D) à 2 mL dans lequel le volume essai V_U est introduit.

1.1 Réactifs pour des volumes essais de 2 à 10 µL

- Solution mère de chromophore Ponceau S à 6,87 g/L. L'absorbance théorique, à 520 nm, en supposant la loi de Beer-lambert linéaire à l'infini est d'environ 313,5 pour un trajet optique de 1 cm. Le Ponceau S n'absorbe pas à 730 nm. En flacon protégeant de la lumière. En eau dégazée. Solution filtrée à travers un filtre de porosité 0,2 µm. Si préparation stérile, Conservation possible 1 mois au réfrigérateur (peut précipiter, resolubiliser par chauffage léger et homogénéisation).
- Tampon zéro : tampon phtalate 0,02 mol/L ajusté à pH 6,0 (4,08 g d'hydrogénophtalate de potassium et 13,3 mL de NaOH à 1 mol/L pour 1 litre). En eau dégazée. Solution filtrée à travers un filtre de porosité 0,2 µm. Le diluant n'absorbe ni à 520 ni à 730 nm. Si préparation stérile, conservation possible 1 mois au réfrigérateur.
- Diluant : tampon zéro contenant 3,74 g/L d'EDTA tétrasodique et 1,12 g/L de CuCl2,2H2O, pH 6,0, filtré sur 0,2 µm et présentant ainsi un pic d'absorbance à 730 nm. N'absorbe pas à 520 nm. Si préparation stérile, conservation possible 1 mois au réfrigérateur.

1.2 Réalisation de la solution étalon

Diluer exactement la solution de mère de Ponceau S avec le diluant selon : V1 = 2 mL à la pipette jaugée deux traits de classe A de solution mère en fiole jaugée de 1 L de classe A (Vfj). Soit R le facteur de dilution, R = 1/500. Homogénéiser (10 retournements). On peut flaconner en rinçant au préalable le flacon avec l'étalon. Il faut absolument boucher et éviter le plus possible toute évaporation. En cas de conservation, il faudra tenir compte de l'évaporation dans le budget d'incertitude. Il est fondamental d'utiliser de la verrerie jaugée de classe A de qualités métrologiques connues. Ainsi l'incertitude-type sur R sera connue. Il n'est pas recommandé de diminuer les volumes V₁ et V_fj car on augmente alors l'incertitude-type sur R et finalement sur V_U. Voici un lien qui ouvre sur les calculs d'incertitude. Où reprendre la présentation de la méthode à deux colorants dans le menu en haut à gauche.

1.3 Mise à zéro du spectrophotomètre

L'idéal est de travailler avec un spectrophotomètre réalisant des mesures en mode multilongueurs d'ondes. Préparer une cuve pour photométrie contenant du tampon phtalate. Régler le photomètre à zéro d'absorbance pour les 2 longueurs d'onde 520 et 730 nm.

1.4 Absorbances de l'étalon et des essais

Vider cette première cuve, la rincer 4 fois avec de la solution étalon et la charger en solution étalon. (Il ne faut absolument pas toucher aux faces optiques, l'idéal serait de pouvoir manipuler sans déplacer la cuve). Lire les absorbances à 520 nm et 730 nm : A_S1 et A_S2 respectivement.
Préparer une nouvelle cuve contenant V_D = 2,00 mL de diluant délivrés à l'aide d'une pipette jaugée 2 traits de classe A. Lire immédiatement les absorbances à 520 nm et 730 nm : A_D1 et A_D2 respectivement.
Ajouter immédiatement à cette cuve (contenant les 2,00 mL de diluant) " V_U " de la solution mère de chromophore, homogénéiser (10 retournements) et mesurer l'absorbance à 520 nm. Soit A_U la valeur obtenue. " V_U " est le volume de la pipette à contrôler.

1.5 Calcul des volumes essais V_U

1.6 Apperçu des valeurs d'absorbance à obtenir


	Volume contrôlé en µL
Valeurs des aborbances	2	5	10
A_S1	vers 0,63
A_S2	vers 0,59
A_S2	vers 0
A_U	vers 0,31	vers 0,78	vers 1,6

1.8 Incertitude-type composée sur V_U

Il faut utiliser le calcul d'incertitude-type composée comme présenté dans la page accessible par le menu en haut à gauche "Présentation : la méthode photométrique à 2 colorants".

L'idéal est d'avoir réalisé une feuille de calculs.
En voici une établie avec le tableur openoffice : incertitude-type composée contrôle p2-10 (.ods).
Et pour ceux qui ne veulent pas d'Openoffice (pourquoi ? essayez !) la version pdf, mais alors y'a pas d'accès aux formules ... incertitude-type composée contrôle p2-10 (.pdf) .

On peut retenir que entre 2 et 10 μL, selon le matériel utilisé, on obtient des incertitudes-types sur les volumes essais V_U vers 0,5% à 0,7%. Soit des incertitudes élargies (k=2, confiance 95%) vers 1 à 1,4%. Ce qui permet de vérifier des pipettes à piston avec des écarts maximum tolérés (EMT) à 5% (un EMT classique) de façon très satisfaisante.

2. Instructions pour des volumes essais (V_U) de 0,4 à 2 µL

2.1 Réactifs pour des volumes essais de 2 à 10 µL

- Solution mère de chromophore Ponceau S à 24,4 g/L. L'absorbance théorique, à 520 nm, en supposant la loi de Beer-lambert linéaire à l'infini est d'environ 1111 pour un trajet optique de 1 cm. Le Ponceau S n'absorbe pas à 730 nm. En flacon protégeant de la lumière. En eau dégazée. Solution filtrée à travers un filtre de porosité 0,2 µm. Si préparation stérile, Conservation possible 1 mois au réfrigérateur (peut précipiter, resolubiliser par chauffage léger et homogénéisation).
- Tampon zéro : tampon phtalate 0,02 mol/L ajusté à pH 6,0 (4,08 g d'hydrogénophtalate de potassium et 13,3 mL de NaOH à 1 mol/L pour 1 litre). En eau dégazée. Solution filtrée à travers un filtre de porosité 0,2 µm. Le diluant n'absorbe ni à 520 ni à 730 nm. Si préparation stérile, conservation possible 1 mois au réfrigérateur.
- Diluant : tampon zéro contenant 3,74 g/L d'EDTA tétrasodique et 1,12 g/L de CuCl2,2H2O, pH 6,0, filtré sur 0,2 µm et présentant ainsi un pic d'absorbance à 730 nm. N'absorbe pas à 520 nm. Si préparation stérile, conservation possible 1 mois au réfrigérateur.

2.2 Réalisation de la solution étalon

Diluer exactement la solution de mère de Ponceau S avec le diluant selon : V₁ = 1 mL à la pipette jaugée deux traits de classe A de solution mère en fiole jaugée de 1 L de classe A (Vfj). Soit R le facteur de dilution, R = 1/1000. Homogénéiser (10 retournements). On peut flaconner en rinçant au préalable le flacon avec l'étalon. Il faut absolument boucher et éviter le plus possible toute évaporation. En cas de conservation, il faudra tenir compte de l'évaporation dans le budget d'incertitude. Il est fondamental d'utiliser de la verrerie jaugée de classe A de qualités métrologiques connues. Ainsi l'incertitude-type sur R sera connue. Il n'est pas recommandé de diminuer les volumes V₁ et V_fj car on augmente alors l'incertitude-type sur R. Voici un lien qui ouvre sur les calculs d'incertitude. Où reprendre la présentation de la méthode à deux colorants dans le menu en haut à gauche.

2.3 Mise à zéro du spectrophotomètre

Voir 1.3

2.4 Absorbances de l'étalon et des essais

Voir 1.4

2.5 Calcul des volumes essais V_U

Voir 1.5

2.6 Apperçu des valeurs d'absorbance qu'on va obtenir


	Volume contrôlé en µL
Valeurs des aborbances	0,5	1	2
A_S1	vers 1,1
A_S2	vers 0,59
A_S2	0
A_U	vers 0,28	vers 0,56	vers 1,1

2.8 Incertitude-type composée sur V_U

Voir 1.8