5. Mode isocratique ou gradient, dégazage des solvants

L'optimisation des analyses (résolution des pics et durée d'analyse) exige souvent de travailler en mode gradient (on va enrichir peu à peu la phase mobile en solvant à fort pouvoir éluant pour rendre la phase mobile de plus en plus éluante). Les appareillages sont ainsi équipés de mélangeurs programmables associés à différentes sources de solvants pour composer à chaque instant la phase mobile. Une chambre de mélange associée à des électrovannes programmées permet ce travail.

Compte-tenu des granulométries faibles des phase stationnaires (5 à moins de 2µm), les solvants doivent être très propres (soigneusement filtrés 0,2µm, achats qualité HPLC...).

L'apparition de microbulles dans le réseau fluidique doit absolument être évitée. Elles entraînent des variations dans les temps de rétention, elles perturbent la plupart des détecteurs (notamment les détecteurs en photométrie d'absorption ou fluorimétrie ou réfractométrie ou ...).

 

Sans dégazage des solvants, des bulles peuvent se former dans la chambre de mélange si elle est située en amont de la pompe (cas très fréquent). L'apparition de bulles est alors due à l'échauffement possible lié au mélange des solvants (par exemple eau et acétonitrile) ou à des diminutions importantes de solubilité du dioxygène ou du diazote qui peuvent apparaître lors de certains mélanges. Ces bulles (les gaz sont très compressibles) vont occasionner, dans le corps de pompe, des variations de débit de pompage et l'injection éventuelle de microbulles bulles dans la colonne. On observera au mieux une perte de reproductibilité des temps de rétention.

La mise en pression de la phase mobile en tête de colonne et le gradient de pression très important qui règne dans la colonne, gradient de pression nécessaire à l'écoulement à travers une phase stationnaire de très faible granulométrie, peuvent occasionner l'apparition de microbulles de dégazage si les solvants n'ont pas été dégazés de l'air (O2 et N2) dissous. Un peu comme chez un plongeur qui remonte trop vite à la surface.

 

Les appareils sont souvent munis de système de dégazage sous vide en ligne. Ces système utilisent des tubes poreux aux gaz mais pas aux solvants placés sous vide. Le dégazage approche les 60% ce qui est suffisant pour éviter l'apparition de bulles par la suite. Les alternatives sont la sonication (ultras sons) et le bullage d'hélium (très simple, très efficace mais il faut travailler avec des solvants non volatiles).

 

Un très bon paragraphe sur ce sujet, très complet à http://www.shimadzu.com/an/hplc/support/lib/lctalk/s5/031.html (octobre 2017).

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