Retours vers :
[Accueil]
[Sommaire du dossier]
JF Perrin mise à jour 2007/2017
[A propos de l'auteur]
[Droits de copie]
Retours vers :
[Accueil]
[Sommaire du dossier]
JF Perrin mise à jour 2007/2017
[A propos de l'auteur]
[Droits de copie]
Il faut obtenir un signal - si possible caractéristique - des analytes élués et qui permettra la quantification. Les possibilités sont variées et dépendent du contexte d'analyse.
Détecteurs photométriques dans l'UV ou le visible (faut que les analytes recherchés absorbent, au moins après dérivatisation éventuelle!). Soit mono longueur d'onde, soit à barrette de diodes pour obtenir des signatures spectrales précises des analytes.
Détecteurs en fluorescence (faut que les analytes recherchés fluorescent, au moins après dérivatisation éventuelle !).
Détecteurs en réfractométrie (utilisent les variations d'indice de réfraction de la lumière), conductimétrie (variations de conductivité), détecteurs électrochimiques polarographiques ou ampérométriques (fondés sur les mesures de courant liés à des réactions redox contre un potentiel fixé).
Spectromètres de masse couplés à la sortie de colonne. Ils diffèrent par leur système d'ionisation (electrospray, ionisation chimique, ionisation photonique ...) et leurs analyseurs (quadripôle, trappe d'ions, temps de vol). C'est un monde technologique devenu récemment d'usage courant, on parle de LC-MS. Les signatures spectrales obtenues conduisent à des identifications sans ambiguité aucune et les quantifications sont très performantes.
Le bruit de fond de la ligne de base est l'ensemble de ses excursions de part et d'autre d'une droite médiane de valeurs. Ces excursions sont des ondulations de tous petits pics parasites et autres petites impulsions. Sur le schéma ci-dessous on a représenté une mesure de bruit de fond réalisée crête à crête (les appareils actuels mesure le bruit de fond sous forme statistique, une variance). La ligne de base est donc affectée du bruit de fond mais elle peut aussi être affectée d'une dérive. La dérive est la déviation (lente) de la moyenne de la ligne de base. La figure ci-dessous illustre bruit de fond et dérive.
Avec la plupart des détecteurs, la surface d'un pic correspondant à une molécule X est proportionnelle à la quantité de X selon un coefficient de réponse qui dépend de X mais caractéristique de X (voir éventuellement justification à http://www.perrin33.com/biochanalys/chromato/picsurfquantit_1.php). Ainsi, les analyses quantitatives demandent d'intégrer l'aire des différents pics d'un chromatogramme.
Les logiciels qui "intègrent" les pics des chromatogrammes utilisent des algorithmes de plus en plus performants, mais il faut toujours inspecter leur travail et valider (ou pas !).
L'intégration ne pose pas trop de problèmes pour les pics bien isolés (on dit bien résolus). Il suffit de savoir détecter le début et la fin du pic, par exemple à l'aide d'une valeur de seuil (threshold) déterminée sur une zone bruitée et d'une méthode utilisant des calculs de dérivées (cf. figure ci-dessous qui présente un cas très basique sans dérive de la ligne de base).
Les algorithmes des logiciels d'intégration des surfaces des pics sont de plus en plus sophistiqués. La figure ci-dessous est une introduction aux problèmes rencontrés.
