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JF Perrin mise à jour 2003/2018
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A cause de la présence des résidus phosphates estérifiés - à chaque base azotée son phosphate estérifié au ribose - on peut considérer que l'ARN est un polyélectrolyte uniformément chargé négativement (1 charge négative par base azotée aux pH de travail en laboratoire). On aurait donc tendance à envisager que ce qu'on a vu pour l'ADN bicaténaire au paragraphe précédent pourrait s'appliquer à l'ARN : effet densité de charge constante et donc mobilité en veine liquide constante quelle que soit la longueur, d'où séparation selon le Log de la taille en gel de porosité définie par effet de frottements différentiels... Et bien c'est faut à cause des structures secondaires qu'adopte l'ARN. Conclusion : si on veut séparer selon un étalonnage de tailles comme en électrophorèse d'ADN double brin, faut dénaturer. Les agents classiques de dénaturation sont le formamide et l'urée (compétiteurs des liaisons hydrogène associés à une température élevée) et le formaldéhyde (le formaldehyde présente un groupe carbonyl qui réagit en base de Schiff avec les fonctions imino ou amino groups des guanine, adenine, and cytosine. Cette "addition de formaldéhyde" empêche l'appariement normal des bases azotées et maintient l'ARN préalablement dénaturé à l'état dénaturé. La réaction n'est pas stable, le formaldehyde doit être présent pour tenir l'état dénaturé d'un ARN. Le formaldéhyde est un agent CMR volatil qui exige des conditions de sécurité très strictes : hotte chimique).
Les gels d'agarose sont utilisés pour des séparations de fragments de plusieurs centaines de bases, les gels de polyacrylamide permettent de séparer à la base près des fragments de plusieurs dizaines de bases.
L'électrophorèse d'un extrait ARN total en gel d'agarose permet de juger de son intégrité. L'ARN étant très fragile, c'est un test très utile pour valider des échantillons ARN.
Traditionnellement on travaille avec une fraction dénaturée à la chaleur en présence de formamide et de formaldéhyde. Puis l'électrophorèse est conduite en gel d'agarose en conditions dénaturantes (en présence de formaldéhyde pour maintenir l'état dénaturé). Travailler en conditions dénaturantes permet d'utiliser un marqueur de tailles mais implique de travailler avec des réactifs dangereux, notamment le formaldehyde (CMR volatil !).
Il existe aussi de nombreux protocoles qui se contentent d'un traitement dénaturant de l'échantillon ARN à la simple chaleur plus formamide. Puis l'échantillon, refroidi brusquement (trempé) est soumis à une électrophorèse en gel d'agarose (vers 1%), non dénaturant. Le profil de migration suffisamment proche de celui en conditions dénaturantes pour juger convenablement de l'intégrité d'un échantillon ARN destiné à utilisation... Ceux qui travaillent avec de l'ARN total non dénaturé en gel non dénaturant sont aussi très nombreux, ce protocole qui supprime les risques chimiques est suffisant pour juger de la qualité d'un extrait ARNtotal. Attention, travailler en conditions non dénaturantes a pour conséquences que des structures secondaires vont se former au sein des ARNs et donc que la migration ne pourra pas être confrontée de façon convenable à une échelle de tailles et que différents repliement d'un même RNA migreront à différentes zones (effet de bandes élargies ...).
Voici un résumé des règles d'intégrité : ratio 2:1 pour les 2 bandes importantes d'ARNr (28S et 18S chez les eucaryotes) ; pas de traînée continue de dégradation aux basses masses moléculaires ; En cas de contaminations d'ADN génomique, des révélations d'ADN apparaissent typiquement coincées au niveau des puits de dépôts.
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Les révélations, classiquement réalisées avec du bromure d'ethidium (un agent intercalant qui fluoresce peu à l'état libre et fortement une fois intercalé, excitation U.V., émission orange) sont plutôt réalisées aujourd'hui avec des substituts fluorescents beaucoup moins toxiques (molécules se liant à l'ARN par exemple, peu fluorescentes à l'état libre et fortement fluorescentes une fois liées, excitation dans le bleu, fluorescence verte).
L'électrophorèse d'ADN en conditions dénaturantes permet de séparer des brins simples en fonction de leur taille en utilisant efficacement des marqueurs de taille puisque les conditions dénaturantes vont empêcher la formation de structures secondaires. Cette technique est très utilisée en gel de polyacrylamide pour séparer au nucléotide près par exemple en séquençage traditionnel. Les dénaturants utilisés sont l'urée et le formamide (compétiteurs des liaisons hydrogènes).