Grandes modalités de conduites des fermentations en milieu liquide en condition immergée

Modes discontinus

1. Mode discontinu non alimenté, non soutiré = en cuvée = en lot = batch

Principe : on lance la culture, elle évolue vers le terme choisi, on récupère la cuvée et dans la cuvée on récupère la production d'intérêt (biomasse ou métabolite ou ...).

Note importante associée : Par convention l'aération d'un bioréacteur n'est pas considérée comme une alimentation/soutirage (y'a pas de réserve de dioxygène dans un milieu, on est obligé de transférer du dioxygène en permanence si le procédé est aérobie...). De même les apports en base ou acide pour régulation de pH ne sont pas concernés par ce qu'on appelle une alimentation de bioréacteur. Même chose pour les éventuels apports en anti-mousse.

Ce mode de conduite génère des phases différentes, préparations, conditionnements, bioréaction à proprement parlé, vidage de la cuve et donc potentiellement de nombreux temps morts. En revanche, c'est simple, notamment pour maintenir la stérilité d'un procédé, et quand c'est simple et que ça marche, pourquoi faire compliqué.

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2. Mode discontinu alimenté, non soutiré = fed-batch

L'alimentation est réalisé avec un milieu concentré chargé de tous les composants du milieu de culture ou de seulement certains. Le volume dans le réacteur augmente donc très sensiblement en cours de procédé. Pas de soutirage en cours de procédé, on récupère la production en une fois en fin de cuvée.

Ce mode de conduite très simple permet :

La gestion efficace d'un effet d'inhibition par le substrat. Exemple : une souche est ralentie au delà de 25 g/L et est même stoppée au delà de 80-100 g/L en source de carbone et d'énergie glucose dans le milieu. On va pouvoir gérer une alimentation en glucose concentrée qui optimise en permanence la concentration en glucose dans le milieu tout en ayant fourni, à la fin du procédé, des quantités énormes de glucose. Et de toute façon si on avait fabriqué un milieu trop chargé, on aurait eu des problèmes de viscosité... (voir l'exemple détaillé un peu plus loin).
La gestion efficace de l'effet Crabtree chez les levures de bière. Chez Sacch. cer et quelques autres espèces proches, des concentration élevées en sucre (> 1 g/L) en condition aérobie déclenchent un métabolisme énergétique essentiellement fermentaire (fermentation alcoolique) et très peu respiratoire. Le métabolisme fermentaire étant énergétiquement à beaucoup plus faible rendement que le métabolisme respiratoire aérobie, le rendement de production de la biomasse est faible en concentrations élevées en sucre dans le milieu (au profit de la production d'éthanol). Ainsi, un producteur de biomasse de levure (pour la boulange par exemple) travaillera en fed-batch en alimentant en continu avec un sirop concentré en sucre mais maintenant une concentration faible en sucre dans la cuvée. A ne surtout pas pratiquer si on veut produire de l'éthanol...
La gestion efficace d'effets divers de type "effet glucose" chez les bactéries. Ainsi des bactéries comme Bacillus subtilis ou E. coli, en procédé aérobie, produisent des acides organiques aux effets rapidement inhibiteurs si la concentration en glucose du milieu est élevée. Il y a donc un intérêt à apporter le glucose en permanence sous une faible concentration globale dans le milieu.
Le contrôle fin de très nombreux phénomènes de répression liés aux nutriments : répressions cataboliques diverses, répressions croisées chez des mutants auxotrophes ...
Le contrôle fin de transitions diauxiques. Un exemple assez classique est celui de la production d'une protéine hétérologue recombinée et placée sous le contrôle d'un promoteur inductible au méthanol chez la levure métylotrophe Pichia pastoris. Une première phase dédiée à la croissance de la souche sera conduite sur le substrat glycérol (source de carbone et d'énergie), le promoteur du gène de la protéine à produire est alors réprimé. A l'épuisement du glycérol - qui occasionnera une remontée du dioxygène dissous - on alimentera le réacteur en méthanol, inducteur de la transcription du gène de la protéine d'intérêt, en contrôlant de façon très strict ce niveau de méthanol dans le bioréacteur. Les productions de protéines hétérologues recombinées chez Pichia pastoris font l'objet d'études de cas à http:\\www.perrin33\genie_ferment\appli\prod_prothetrec_0.php.

Fed-batch et inhibition par le substrat. Un exemple pratique.

On souhaite produire de la biomasse d'une souche d'un micro-organisme chimio-organotrophe aérobie strict en procédé discontinu en réacteur industriel. La source de carbone et d'énergie du milieu est le glucose. En phase de croissance (exponentielle), le rendement de conversion du glucose en biomasse (Y_X/S) a été mesuré à 0,4 g de biomasse sèche par g de glucose. Les concentrations élevées en glucose deviennent inhibitrices pour la souche au delà de 25 g/L dans le milieu de culture. On souhaite produire en discontinu, en arrêtant le procédé en fin de phase de croissance dès que le glucose, limitant, s'épuise. On souhaite obtenir une concentration finale en biomasse sèche de 4 % (40 g/L) dans le réacteur à partir d'un milieu inoculé au départ à 0,008 % (0,08 g/L) en matière sèche. Pour alimenter en fed-batch, on dispose d'une solution milieu à 300 g/L en glucose.

On peut montrer facilement qu'un fed-batch sera nécessaire. En effet le besoin en glucose (SN) pour passer de 0,08 g/L à 40 g/L en biomasse sèche est estimé à SN = ([X]_finale - [X]_initiale)/Y_X/S = (40-0,08)/0,4 = 99,8 g/L (100 g/L). On est largement supérieur à 25 g/L, un fed-batch est bien nécessaire.

On donne désormais tous les paramètres de la production qui vont permettre de calculer l'alimentation fed-batch nécessaire :

Volume de milieu y compris l'inoculum au départ	Concentration en glucose au départ	Objectif de croissance	Rendement de conversion du glucose en biomasse	[glucose] de la solution d'alimentation	Volume d'alimentation nécessaire
V₀	C₀	[X]_finale et [X]_initiale	Y_X/S	C_sirop	V_feed
10 m³	22 g/L (kg/m³)	[X]_finale = 40 g/L et [X]_initiale = 0,08 g/L (ou kg/m³)	0,4 g de biomasse sèche par g de glucose (ou 0,4 kg/kg)	=300 g/L (kg/m³)	L'inconnu à déterminer

On peut commencer par une résolution "grossière" du problème. On va supposer que le volume d'alimentation nécessaire sera faible devant V₀. On peut alors raisonner simplement. En approche grossière, le besoin en glucose exprimé en concentration est [SN] =([X]_finale-[X]_initiale)/Y_X/S=39,92/0,4=99,8 g/L (kg/m³). On devra donc alimenter par l'équivalent de 99,8 - 22 = 77,8 kg/m³ de glucose et ce pour le volume V₀ de 10 m³ soit 77,8 * 10 = 778 kg de glucose.
Si l'apport est réalisé avec un sirop à 300 kg/m³ il faudra donc V_feed = 778/300 = 2,59 m³.
Il faudra ajuster le débit d'alimentation afin qu'en permanence la concentration résiduelle en glucose dans la cuve de fermenteur reste toujours inférieure à 25 g/L. Problème, le calcul est faux car 2,59 m³ est loin d'être négligeable devant 10 m³ ! Donc le volume d'alimentation nécessaire sera bien plus élevé que ne le prévoit notre calcul grossier. Une résolution plus subtile du problème s'impose...

On va construire une équation complète et exacte permettant de calculer V_feed : $$ \left\{ \begin{array}{l} volume~final~=~V_0+V_{feed}\\ Besoin~en~glucose~(en~masse)~=~Apport~total~en~glucose~(en~masse)\\ Apport~en~glucose~=~C_0V_0+C_{sirop}V_{feed}\\ Besoin~en~glucose~=~\cfrac{[X_{finale}]*{volume~final}-[X_{initiale}]*V_0}{Y_{X \setminus S}}\\ \end{array} \right. $$

D'où :
$$ \left\{ \begin{array}{l} \cfrac{[X_{finale}]*{(V_0+V_{feed})}-[X_{initiale}]*V_0}{Y_{X \setminus S}}~=~C_0V_0+C_{sirop}V_{feed}\\ Equation~à~une~seule~inconnue~:~V_{feed} \end{array} \right. $$ Soit (aux valeurs numériques) :
$ \cfrac{40 *{(10+V_{feed})}-0,08*10}{0,4}~=~22*10+300*V_{feed} $
$\cfrac{400+40*V_{feed}-0,8}{0,4}~=~220+300*V_{feed} $
$\cfrac{399,2+40*V_{feed}}{0,4}~=~220+300*V_{feed} $
$399,2+40*V_{feed}~=~0,4*(220+300*V_{feed}) $
$399,2+40*V_{feed}~=~88+120*V_{feed} $
$80*V_{feed}~=~311,2 $
$V_{feed}~=~\cfrac {311,2}{80}~=~3,9~m³ $
Et ce n'est pas du tout les 2,6 m³ trouvés dans la prévision grossière précédente ...CQFD.

Fed-batch et production de protéines hétéroloques recombinées, exemples pratiques.

Voir les pages dédiées à http:\\www.perrin33\genie_ferment\appli\prod_prothetrec_0.php.

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3. Modes discontinus avec cellules immobilisées et recirculation du milieu

Très simple à expliquer avec un schéma. On récupère la cuvée en fin de lot et on peut relancer éventuellement une nouvelle cuvée avec du milieu neuf ...

On trouve parfois ce type de montages dans des publications de recherches. Je ne connais pas d'application industrielle ...

recirculations sur cellules immobilisées

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