westernblot 2

Western blot classique : membranes, transferts, révélations

Membranes

Deux grands types de membranes d'épaisseur et de porosité adaptée (100 µm d'épaisseur, 0,1 - 0,45 µm de porosité) sont utilisées pour leur bonne aptitude à adsorber toutes les protéines (alors qu'elles sont dénaturées, liées à du sodium-dodecyl sulfate puisqu'en général l'étape d'électrophorèse est une SDS-PAGE). Il s'agit de la nitrocellulose et du PVDF (polyvynilidene fluoride). Les adsorptions sont dues principalement à des interactions hydrophobes (le squelette covalent d'une protéine dénaturée est globalement hydrophobe). Les adsorptions se réalisent sur la trame solide poreuse de la membrane. Et il faut que l'accès soit "facile" pour les révélations immunochimiques ultérieures (voir après).

Transferts

On distingue 3 types d'électrotransfert : wet (humide, immergé en cuve), semi-dry (semi-sec) et dry (sec) (des abus de langage).

Wet (humide, immergé en cuve). On construit le "sandwich de transfert" : éponge fibreuse imprégnée/ papier absorbant imprégné / gel d'électrophorèse / membrane de transfert / papier absorbant imprégné / éponge fibreuse imprégnée. Puis le "sandwich de transfert" , comprimé par une grille support, est plongé dans une cuve de solution tampon de transfert qui porte les 2 électrodes permettant de générer le champ électrique perpendiculaire de transfert. La solution tampon de la cuve doit être refroidie pendant le transfert (sinon ça chauffe énormément avec des convections...En effet, l'essentiel du courant concerne les ions du tampon. Durée d'un transfert 45 minutes à 2 heures.
Semi-dry (semi-sec). On construit unn "sandwich de transfert" : papier absorbant imprégné (généreux, 3 mm) / gel d'électrophorèse / membrane de transfert / papier absorbant imprégné (généreux, 3 mm). Ce sandwich va être placé horizontalement directement au contact de 2 électrodes planes de graphite. Attention, le papier imprégéné doiit être juste aux dimensions du gel et ne pas déborder et "cour-cicuiter" le transfert. Durée d'un transfert 10 minutes à 20 minutes.
Dry (sec). Gros abus de langage qui désigne des électrotransferts à l'aide d'appareils qui proposent des systèmes en kit avec transfert rapide. Grosso modo, on place dans l'appareil générateur de champ électrique un premier ensemble préfabriqué à usage unique comportant une membrane de cuivre (pôle positif, anode) recouverte de "l'éponge de tampon de transfert" elle même recouverte de la membrane de son choix. Y'a plus qu'à placer le gel d'électrophorèse par dessus puis un ensemble préfabriqué à usage unique "éponge tampon" / membrane de cuivre. Et avec le voltage adéquat, le transfert est réalisé en quelques minutes. (L'anode en cuivre, se dissous en cours de transfert : Cu--> Cu2+ + 2e, et évite la formation de dioxygène par électrolyse au contact d'une électrode classique inerte. Il paraît que cette absence de bulles de dioxygène évite des distorsions ...).

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Blocage des sites non spécifiques

Préalable aux détections immunochimiques, le "blocage" (saturation) de tous les sites d'adsorption des protéines par la membrane, sites non spécifiques évidemment. Avec une solution protéique de type caséine (en pratique du lait écrémé ou de la sérumalbumine bovine en tampon PBS). Et on rince bien.

Anticorps

Donc la règle générale est celle des révélations indirectes.

On peut travailler avec des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Si on travaille avec un anticorps monoclonal il devra reconnaître un épitope séquentiel (et pas conformationnel) puisque on travaille en général avec des protéines dénaturées issues de SDS-PAGE.

Il faut bien rincer entre chaque étape avec un tampon suffisamment stringent pour ne conserver que les liaisons spécifiques (sinon gare au bruit de fond !). En général, un peu de détergent type Tween 20 dans le tampon de rinçage permet d'éliminer les interactions non spécifiques.

Révélations

En cas d'anticorps conjugué à la peroxydase (HRP). Presque tous les laboratoires utilisent une réaction chimiluminescente du type :

De nombreux laboratoires utilisent des anticorps marqués par des fluorochromes. La mode est à la fluorescence dans le proche infrarouge (il n'y a en effet que très peu d'interférences dans ces domaines de longueurs d'onde par l'autofluorescence des membranes et des divers composés biologiques susceptibles de fluorescer).

Traitement du signal pour analyse des résultats

Les marquages avec enzyme et chimiluminescence ou fluorochromes dans le proche infra-rouge (NIR, near infrared) demandent l'acquisition d'un signal en émission de photons. Les fabricants proposent des appareillages à capteurs CDD qui permettent une analyse quantitative de l'émission. Evidemment, en fluorescence, faut ajouter la source d'excitation.

Les analysses quantitatives utilisent en général un "étalon interne", par exemple une protéine de ménage d'expression supposée constante, par exemple la β-actine (vaut mieux valider cette constance d'expression dans le cadre de chaque étude !).

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