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JF Perrin mise à jour 2020
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Les techniques dites immunoenzymatiques ou immunoenzymologiques utilisent des enzymes couplés à des antigènes oou des anticorps comme marqueurs. On peut utiliser des révélations immunoenzymatiques en histologie, en cytologie, lors de Western-blot, pour des dosages de substances.
Les IgG sont les anticorps de la plupart des méthodes immunoenzymatiques.
Les conjugués anticorps-enzyme les plus utilisés sont les conjugués IgG-peroxydase de raifort (IgG-HRP, HRP = Horse Radish Peroxidase).
Mais d'autres enzymes de marquage existent même si ils sont d'utilisation rare : β-galactosidase, phosphatase alcaline...
Dans certaines techniques, comme les ELISA compétitions ou les méthodes EMIT, de l'antigène "compétiteur" est utilisé et il est conjugué avec une enzyme.
Les marquages enzymatiques sont utilisés dans 4 grands types chimiques de révélations : des réactions qui développe un produit soluble "coloré" mesurable par photométrie d'absorption moléculaire, des réactions qui produisent un produit fluorescent mesurable par fluorimétrie, des réaction qui s'accompagnent d'une chimiluminescence mesurée, des réactions qui produisent un produit qui précipite à son lieu de formation (pour observations histologiques par exemple).
Voici quelques exemples dans le cas des conjugués avec peroxydase de raifort (HRP).
L’anticorps secondaire doit être dirigé contre l’isotype marqueur d'espèce de l’anticorps primaire. Les anticorps primaires polyclonaux sont généralement obtenus chez le lapin, la chèvre, le mouton et sont généralement des isotypes d’IgG. L’anticorps secondaire est donc typiquement un anticorps anti-IgG de lapin, de chèvre, de mouton... Les anticorps primaires monoclonaux sont couramment obtenus chez la souris, le lapin et le rat. ainsi, si l’anticorps primaire monoclonal est une IgG de souris, on aura besoin d'un secondaire IgG anti-souris (ou d’un fragment moins spécifique F(ab) d’IgG anti-souris).
L'intérêt des conjugués anticorps enzyme secondaires c'est l'amplification du signal et le caractère "non dédié", c'est à dire utilisable dans tous les contextes ou l'anticorps primaire est de l'espèce reconnue.
La protéine avidine (issue de l'oeuf) où ses "analogues" comme la streptavidine possèdent une affinité sélective très élevée pour le cofacteur organique d'enzyme biotine. Une avidine possède 4 sites de fixation pour la biotine.
Des conjugués anticorps-biotine (secondaires) sont ainsi utilisables dans des révélations avec avidine et conjugués peroxydase-biotine. Le système est très amplificateur du signal, il est très utilisé en immunohistochimie.
Epitopes séquentiels ou continus ou linéaires : formés par quelques acides aminés contigus d'une protéine. Un anticorps qui reconnaît un tel épitope reconnaîtra la protéine qui le porte même si elle est dénaturée.
Épitopes discontinus ou conformationnels : formés d'acides aminés qui ne sont pas contigus dans la séquence primaire, mais qui sont placés à proximité immédiate lorsque la protéine est repliée dans sa conformation native particulière. De telles épitopes disparaissent à la dénaturation (au changement de conformation en leur lieu).
Conclusion : Un anticorps monoclonal qui reconnaît un épitope conformationnel ne pourra être utilisé sur une forme dénaturée de l'antigène (par exemple en westernblot après SDS-PAGE). Ainsi en westernblot, il est souvent intéressant d'utiliser des anticorps polyclonaux qui vont reconnaître différents épitopes de différents types de l'antigène ciblé.