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JF Perrin mise à jour 2020
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ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay. Pour mesurer quantitativement des antigènes selon des méthodes immunoenzymatiques en phase hétérogène. La phase hétérogène est utilisée pour séparer une fraction libre et une fraction liée. On va finalement mesurer une activité enzymatique immobilisée.
En général on travaille en plaques 96 puits, une phase est la paroi des puits où sera immobilisée une fraction liée l'autre est une phase liquide de contenu des puits.
Dans les méthodes avec compétition, l'antigène à mesurer et de l'antigène marqué seront mis en compétition pour immunocapture ou un anticorps marqué sera confronté à de l'antigène à doser en phase soluble ou de l'antigène immobilisé en compétition.
Peut-être signaler que le premier dosage utilisant des "outils anticorps" fut un dosage compétition. C'était un dosage d'insuline et le marquage du compétiteur n'était pas une enzyme mais un marquage radioactif (Yalow et Berson, 1956, dosage radioimmunologique de l'insuline, Yallow est prix Nobel 1977).
l'antigène à mesurer et de l'antigène marqué sont mis en compétition pour immunocapture.
La fonction d'étalonnage est évidemment décroissante : plus il y a d'antigène "froid", moins il y a d'antigène marqué qui "gagne" la compétition pour s'immobiliser sur les anticorps de capture. (Voir allure en §2.2)
Un anticorps marqué sera confronté à de l'antigène à doser en phase soluble ou de l'antigène immobilisé en compétition.. Voici ci-dessous un exemple de dosage ELISA compétion de l'atrazine, le schéma de principe (on voit que l'anticorps de révélation - en fait un fragment FAB-conjugué HRP - est mis en compétition devant l'atrazine libre à doser ou de l'atrazine immobilisée sur support). La figure montre l'allure classique d'une courbe d'étalonnage : plus il a d'antigène froid moins l'enzyme de marquage est immobilisé. Ainsi la fonction est décroissante.
Le traitement des données en dosage ELISA mériterait un long chapitre mais on peut donner quelques grandes idées.
Dans de nombreux cas on peut trouver une linéarisation acceptable sur un domaine de praticabilité pour des fonctions du type signal=f(ln[antigène étalon)]. Mais, selon les dosages, on peut se voir proposer d'autres fonctions qui permettent un plus grand domaine de praticabilité. Les plus connues, qui exigent de l'informatique récente, sont les fonctions logistiques à 4 paramètres et 5 paramètres. On trouve aussi parfois des régressions selon des polynômes de degré 3.
Pour ceux que ça intéresse, les modèles logistiques à 4 paramètres et 5 paramètres sont décrits par :
\(
y = d + \cfrac {a-d} {1+ \left(\cfrac {x}{c}\right)^b}
\)
et
\(
y = d + \cfrac {a-d} {\left(1+ \left(\cfrac {x}{c}\right)^b \right)^g}
\)
Plus d'informations, mais faut y passer un peu de temps :
Il peut être intéressant de travailler les données de concentration de l'antigène à doser en concentrations relatives : dilutions de l'échantillon et dilution d'un étalon stock. Si on obtient des fonctions de réponse "parallèles" cela signifie un comportement à l'identique des réactions que soit avec l'étalon ou l'échantillon et participe donc à valider le dosage. A l'opposé un "non parallélisme" signe une interférence à étudier. Un tel traitement des données permet aussi le calcul de la concentration d'un échantillon qui tient compte de façon pondérée de toutes les dilutions testées.
Plus d'informations, mais faut y passer un peu de temps :
Et pour ceux qui veulent essayer, un programme Python (à interface graphique, testé en Python 3.7 et 3.9, bibliothèques numpy/matplotlib et scipy nécessaires) qui permet de traiter facilement des données étalon et essai obtenues sur gamme de dilutions. Téléchargeable par : logipara51.py
Ci-dessous, quelques notes pour installer Python et les bibliothèques permettant de lancer le programme logipara46.py :
Télécharger le logiciel Python à https://www.python.org/downloads/ . Puis réaliser l'installation.
Sous Windows penser à cocher "Add Python x.x to PATH", ça permettra aux fichiers .py d'être exécutés de partout par double clic sans se compliquer la vie. Faire une installation "customized", première page réglages par défauts, puis en cochant la case "pour tous les utilisateur", c'est mieux et ça installe ainsi par défaut dans "c:\program files".
Faudra installer la bibliothèque numpy. En mode commande : pip install numpy
Faudra installer la bibliothèque matplotlib. En mode commande : pip install matplotlib
Faudra installer la bibliothèque scipy. En mode commande : pip install scipy