Retours vers :
[Accueil]
[Sommaire du dossier]
JF Perrin mise à jour 2020
[A propos de l'auteur]
[Droits de copie]
Retours vers :
[Accueil]
[Sommaire du dossier]
JF Perrin mise à jour 2020
[A propos de l'auteur]
[Droits de copie]
ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay. Pour mesurer quantitativement des antigènes selon des méthodes immunoenzymatiques en phase hétérogène. C'est la phase hétérogène qui permet de séparer une fraction libre et une fraction liée. On va finalement mesurer une activité enzymatique immobilisée.
En général on travaille en plaques 96 puits, une phase est la paroi des puits où sera immobilisée une fraction liée l'autre est une phase liquide de contenu des puits.
Dans la plupart des cas, on s'arrange capturer l'antigène à doser sur la paroi des puits grâce à un anticorps de capture immobilisé au préalable sur ces mêmes parois. Pour cela on utilise des plastiques qui adsorbent les protéines (donc les anticorps). Ceci impliquera donc une phase de saturation des sites d'adsorption avec une protéine neutre. Et évidemment, il faut que l'antigène à mesurer possède au moins deux déterminants antigéniques différents (voir schéma ci-dessous).
Lavage stringent : signifie que le tampon de lavage ne doit conserver immobilisé que le spécifiquement reconnu par interaction antigène-anticorps et décrocher le reste. Pour cela, très généralement, on utilise un tampon PBS (Phosphate Saline Buffer) standard et on déstabilise les interactions non spécifiques en particulier les interactions hydrophobes avec ajout d'un détergent comme le tween20 (0,05%) dans le tampon. On peut parfois jouer sur la force ionique par jout de NaCl.
Si l'antigène à mesurer présente de bonnes capacités à s'immobiliser simplement et quantitativement sur les parois utilisées, on peut concevoir des ELISA très simples en mode direct et indirect. Comme résumé par le schéma ci-dessous. C'est très très peu fréquent comme technique.
Dans le terme ELISA sandwich, le mot sandwich fait référence au fait que l'antigène à doser est capturé à l'aide d'un anticorps immobilisé avant d'être mesuré par un deuxième système anticorps en mode direct ou indirect. Comme résumé par le schéma ci-dessous.
L'antigène à doser peut être un anticorps... cf exemple ci-dessous.
Exemple de mesure d'antigène de SARS COV-2 par ELISA avec marquage enzymatique phosphatase alcaline.
Le traitement des données en dosage ELISA mériterait un long chapitre mais on peut donner quelques grandes idées.
Dans de nombreux cas on peut trouver une linéarisation acceptable sur un domaine de praticabilité pour des fonctions du type signal=f(ln[antigène étalon)]. Mais, selon les dosages, on peut se voir proposer d'autres fonctions qui permettent un plus grand domaine de praticabilité. Les plus connues, qui exigent de l'informatique récente, sont les fonctions logistiques à 4 paramètres et 5 paramètres. On trouve aussi parfois des régressions selon des polynômes de degré 3.
Pour ceux que ça intéresse, les modèles logistiques à 4 paramètres et 5 paramètres sont décrits par :
\(
y = d + \cfrac {a-d} {1+ \left(\cfrac {x}{c}\right)^b}
\)
et
\(
y = d + \cfrac {a-d} {\left(1+ \left(\cfrac {x}{c}\right)^b \right)^g}
\)
Plus d'informations, mais faut y passer un peu de temps :
Il peut être intéressant de travailler les données de concentration de l'antigène à doser en concentrations relatives : dilutions de l'échantillon et dilution d'un étalon stock. Si on obtient des fonctions de réponse "parallèles" cela signifie un comportement à l'identique des réactions que soit avec l'étalon ou l'échantillon et participe donc à valider le dosage. A l'opposé un "non parallélisme" signe une interférence à étudier. Un tel traitement des données permet aussi le calcul de la concentration d'un échantillon qui tient compte de façon pondérée de toutes les dilutions testées.
Plus d'informations, mais faut y passer un peu de temps :
Et pour ceux qui veulent essayer, un programme Python (à interface graphique, testé en Python 3.7 et 3.9, bibliothèques numpy/matplotlib et scipy nécessaires) qui permet de traiter facilement des données étalon et essai obtenues sur gamme de dilutions. Téléchargeable par : logipara51.py
Ci-dessous, quelques notes pour installer Python et les bibliothèques permettant de lancer le programme logipara46.py :
Télécharger le logiciel Python à https://www.python.org/downloads/ . Puis réaliser l'installation.
Sous Windows penser à cocher "Add Python x.x to PATH", ça permettra aux fichiers .py d'être exécutés de partout par double clic sans se compliquer la vie. Faire une installation "customized", première page réglages par défauts, puis en cochant la case "pour tous les utilisateur", c'est mieux et ça installe ainsi par défaut dans "c:\program files".
Faudra installer la bibliothèque numpy. En mode commande : pip install numpy
Faudra installer la bibliothèque matplotlib. En mode commande : pip install matplotlib
Faudra installer la bibliothèque scipy. En mode commande : pip install scipy