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JF Perrin mise à jour 2020
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Ce chapitre est traité par une étude de cas. A partir d'une publication de 2011 (pas très récente mais instructive), Seakwoo Lee1, Doris Terry, Douglas R. Hurst, Danny R. Welch, and Qing-Xiang Amy Sang. Protein Signatures in Human MDA-MB-231 Breast Cancer Cells Indicating a More Invasive Phenotype Following Knockdown of Human Endometase/ Matrilysin-2 by siRNA. Journall of Cancer 2011; 2:165-176.
Le contexte, lecture. La protéine humaine MMP-26 est une protéine qui promeut le caractère métastasique de certaines cellules cancéreuses où elle est surexprimée et peut être utilisé comme marqueur dans certains cancers. Dans cette étude, les chercheurs souhaitent identifier quelles protéines verraient leur expression directement ou indirectement modifiée sous l'effet des variations d'expression de MMP-26. Pour cela ils utilisent une lignée cellulaire cancéreuse humaine MDA-MB-231 et ils éteignent l'expression de MMP-26 (knockdown expression) chez cette lignée par une technique avec transfection d'un vecteur transcrivant un siRNA (il n'est pas besoin de connaître cette technique pour comprendre la suite). Deux lignées sont construites, une avec extinction de MMP-26 avec siRNA (lignée si), une autre qui a subi une transfection transcrivant un RNA dit "scramble" (brouillé) et dont l'expression de MMP-26 n'est donc pas éteinte (lignée scr). La lignée "scr" a ainsi subi le "même traitement" que la lignée "si" mais sans effet "knockdown" et pourra donc faire office de lignée témoin.
A partir de là, le travail s'organise ainsi :
Il s'agit donc désormais d'identifier la nature des protéines sélectionnées et pour l'instant dénommées 1 à 8. Et c'est là, où on va utiliser une analyse par spectrométrie de masse dont les résultats vont être mis en relation avec des données informatisées.
On va traiter la cas de la protéine 4 (surexprimée quand MMP-26 est éteinte). La question est de savoir qui elle est ? Et pour l'instant on ne lui connaît que 2 traits, son pH isoélectrique (pI) et sa masse moléculaire. En effet si on reprend les électrophorèses 2D on voit que le spot 4 correspond à un pI vers 5,3 et une masse moléculaire un peu en dessous de 36 kDa (voir la figure ci-dessus).
La spectrométrie de masse va permettre d'obtenir une "photographie" beaucoup plus spécifique de cette protéine (MassFingerPrint). On va :
Voici ci-dessous ce que donne la protéine 4 sur laquelle on enquête.
Il s'agit de confronter une empreinte spectrométrique de protéine à une base de données ayant en stock les empreintes possibles de toutes ses protéines après hydrolyse à la trypsine. Et de voir si une protéine connue sort avec une grande probabilité devant les autres protéines. Le plus simple est de comprendre en testant la protéine 4. On va utiliser le logiciel en ligne MASCOT Peptide Mass Fingerprint.
Pour cela :
Voici ci-dessous l'allure du formulaire à remplir et comment le remplir. Et aussi
la liste des m/z des peptides détectés dans le spectre (faudra faire un copier/coller), à savoir :
1106.48
1340.50
1704.83
1799.83
1802.79
2871.33
2888.40
Le résultat que vous devriez obtenir a cette allure :
Soyons fous, cliquez sur le lien bleu "ANXA5 HUMAN" pour avoir des détails ! Il devrait vous apparaître la fenêtre :
En résumé, la prédiction du spot4 comme étant ANXA5 paraît très crédible. Aucune autre protéine n'est candidate. Seul bémol, un peptide proposé ne correspond pas. Si vous allez voir l'article qui a servi à réaliser ce cours, vous verrez que le travail de prédiction pour le spot4 n'a pas été réalisé avec 7 valeurs tirées du spectre mais 20 peptides qui couvraient 68% de la séquence de ANXA5 et vous verrez que ANXA5 a été confirmée par une technique Westernblot (donc grâce à un anticorps spécifique). Puis évidemment, les auteurs utilisent leur travail analytique pour faire de la biologie sur leur sujet, mais là n'est pas notre propos.
Avec des spectromètres de masse dits MS/MS (car il y aura 2 séparations en série) on peut :
Le lien vers https://www.researchgate.net/figure/MALDI-TOF-MS-MS-spectra-of-fragmented-peptides-from-a-AIC3-Above-parent-ion_fig1_331624799 ouvre sur une image qui présente deux spectres de "molécules-ions fils" issus chacun d'un peptide parent et les séquences déduites. C'est un métier ...
Conclusion : On a des signatures peptidiques séquencées. On ne peut pas mieux.
Les études de protéomes par spectrométrie de masse sont réalisés sur des plateformes techniques dédiées. En effet, c'est un savoir-faire très très technique.
L'analyse des spectres des hydrolysats peptidiques demande beaucoup d'expertise :
