FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer, définitions, principe

FRET est un acronyme anglais. En français on devrait parler de transfert d'énergie entre molécules fluorescentes ou transfert d'énergie par résonance de type Förster. Förster fait référence à un physicien qui a théorisé le phénomène dans les années 1940. D'ailleurs, pour certains l'acronyme FRET s'entend comme Förster Resonance Energy Transfer.

RET

D'après la théorie physique, le transfert d'énergie par résonance est défini comme un transfert d''énergie non radiatif (sans émission de lumière !!) résultant d''une interaction dipôle – dipôle entre deux molécules, un donneur à l'état excité et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique et de distance et d'orientation entre les 2 molécules partenaires. La compatibilité énergétique est simple à concevoir : l'énergie de retour du donneur de l'état excité à fondamental doit correspondre à une transition énergétique possible de l'accepteur de l'état fondamental vers un état excité.

FRET

Il y a FRET Lorsqu'il y a transfert d'énergie par résonance entre un groupement fluorescent D (donneur) excité par des photons et un groupement absorbant et/ou fluorescent R (receveur). L'énergie associée à l'état excité de A est transférée par résonance sur B ; c'est-à-dire que l'état A excité induit un champ électrique oscillant qui entre en résonance avec les électrons de B si B possède la transition énergétique convenable : A se désexcite de façon non radiative alors que B passe à l'état excité. Le retour de B excité vers l'état fondamental est alors soit non radiatif si B est un chromophore simple ou radiatif si B est un fluorescent (émission de lumière, luminescence de B). La condition pour que le transfert d'énergie s'effectue est évidemment que le spectre d'émission du donneur A et le spectre d'excitation du receveur B se recouvrent. Le transfert d'énergie par résonance est un transfert d'énergie à courte distance sous forme non radiative. Il exige une très grande proximité de A et B (1 à 10 nm en règle générale) et une orientation convenable. A titre de comparaison et d'échelle, les longueurs de liaison covalente entre 2 atomes sont de 0,1 à 0,2 nm.

fret-principe 1

fret principe 2

Au niveau des observations expérimentales, le phénomène de FRET va se traduire par :
- 1) En excitant à une longueur d'onde spécifique du donneur, la fluorescence caractéristique du donneur est affaiblie ou éteinte (au profit de l'émission de l'accepteur si il est fluorescent) ;
- 2) quand un fluorophore a été excité (l'excitation demande environ 10-15 s), il se relâche vers l'état excité de plus bas niveau avec production de chaleur en 10-14 à -11 s, puis il demeure excité de l'ordre de 10-9 à -8 s (1 à 10 ns) avant la retombée à l'état fondamental avec émission de fluorescence. Comme pour un phénomène de décroissance radioactive, on est face à un phénomène statistique et on va pouvoir mesurer la constante de temps de la décroissance exponentielle de l'état excité ou la demi-vie de l'état excité du fluorophore. Le phénomène de FRET accroît la probabilité de retour du donneur à son état fondamental : la vie à l'état excitée est raccourcie. Des excitations conduites à l'aide de pulses LASER et associées à des détecteurs à haute résolution temporelle permettent d'évaluer ce phénomène (on travaille à la ns !!).

Les 2 points ci-dessus sont traités plus en détails dans le chapitre 2, voir menu à gauche...

Les applications au laboratoire utilisant un effet de FRET sont très très nombreuses :
•  utilisation comme "règle moléculaire" pour étudier et mesurer des structures et conformations protéiques, des interactions protéines/ligands, des structures d'acides nucléiques ;
•  à la base du signal de nombreux systèmes de PCR quantitative ;
•  systèmes très variés de biocapteurs utilisés en imagerie cellulaire ;
• systèmes pour mesurer les potentiels de membranes, suivre des fusions membranaires...
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