Energie des photons U.V. et visibles et transitions énergétiques

3. FRET avec accepteur fluorescent

Un exemple simple : détection d'activité caspase-3 par FRET entre le donneur fluorescent MiCy et l'accepteur fluorescent mKO

La caspase 3 est une protéase intervenant dans les phénomènes d'apoptose et reconnaissant bien la séquence DEVD (Asp-Glu-Val-Asp |), séquence non reconnue par les autres caspases.

MiCy est une protéine fluorescente qui est utilisée comme donneur. mKO est une protéine fluorescente qui est utilisée comme accepteur. On construit une protéine recombinée MiCy-GGSGGDEVDGTGGS-mKO.

La protéine recombinée propose un phénomène de FRET entre MiCy et mKO. Hydrolysée par la caspase 3, MiCy et mKO devenus "indépendants" ne proposent plus de FRET. On a ainsi construit un "biocapteur-à-caspase3".

fret intensité vue par les spectres

Le biocapteur-à-caspase3 ainsi créé a été mis à exprimer dans des cellules HeLas. Les cellules sont mises en cultures et observée avec une caméra CCD à 495 nm et 559 nm sous éclairage 440 nm à différents temps après traitement avec des anticorps anti-Fas et du cycloheximide, ce qui va déclencher l'apoptose et donc une activité caspase-3. On observe :

(Note : la dimérisation de Micy, qui n'a pas de conséquence dans le cas évoqué, n'est pas représentée... voir l'article...)

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