2. Mesurer l'efficacité de FRET

Pour évaluer l'efficacité d'un FRET, on réalise des mesures d'intensité de fluorescence aux longueurs d'onde d'émission du donneur et de l'accepteur après excitation spécifique du donneur ou on réalise des mesures de durée de vie de l'état excité du donneur.

2.1 Efficacité de FRET par mesures d'intensité d'émission du donneur (D)

On excite à une longueur d'onde qui excite le donneur mais pas l'accepteur. On mesure l'intensité d'émission au pic d'émission du donneur (dans l'idéal l'accepteur ne doit pas émettre à cette longueur d'onde). l'intensité d'émission au pic d'émission de l'accepteur (dans l'idéal le donneur ne doit pas émettre à cette longueur d'onde, c'est pourtant assez fréquent).

L'efficacité de FRET peut être évaluée par : $$E_{FRET}=\frac{{nbre~photons~émis~par~D~isolé}-{nbre~photons~émis~par~D~en~FRET}}{nbre~photons~émis~par~D~isolé}=1- \frac{nbre~photons~émis~par~D~en~FRET}{nbre~photons~émis~par~D~isolé}$$

Soit D le donneur isolé, soit A l'accepteur isolé, soit A-D la situation de proximité où il y a FRET, soit ID/D l'intensité d'émission de D dans un essai avec D isolé, soit ID/A-D l'intensité d'émission de D dans un essai avec D-A à la même concentration que dans l'essai précédent.

On peut réécrire de façon très pratique la formule d'efficacité donnée ci-dessus et qui devient :

$$E_{FRET}=1-{\frac{I_{D/A-D}}{I_{D/D}}}$$

2.2 Efficacité de FRET et traçage manométrique de proximité entre donneur et accepteur

Ce qui fait la puissance des outils utilisant l'effet FRET, c'est la sensibilité à la distance séparant le donneur (D) et l'accepteur (A). La loi physique (en puissance 6 !) est la suivante :

Soit R la distance entre D et A et R0 la distance entre D et A qui conduit à une efficacité de FRET de 0,5, on a :

$$E_{FRET}=\frac{1}{1+{ \left( {\frac{R}{R_0}} \right)^6}}$$

Soit par exemple un couple A et D classique pour lequel R0 = 5 nm. L'effet puissance 6 de la loi des distances fera que dès la distance de 1,5 fois R0, soit seulement 7,5 nm, le phénomène de FRET aura une efficacité de (1/2,5)6 = 0,004 ce qui correspond à un effondrement total. A la distance de 3 fois R0 soit seulement 15 nm, le phénomène de FRET aura une efficacité de (1/4)6 = 0,00024 ce qui correspond à moins de 1 pour 4000 ! autant dire plus rien.

Le phénomène de transfert d'énergie par résonance entre Donneur et acccepteur est très sensible à la distance et est très utilisé comme traceur de distance manométrique entre A et D.

2.3 Evaluer le FRET par mesure de ratio Intensité émission accepteur / Intensité émission donneur

Dans les cas très fréquent des systèmes de FRET qui utilisent un donneur et un accepteur fluorescent dans un assemblage 1 pour 1 et qui suivent un évènement FRET/ disparition du FRET, on peut suivre en mesurant un rapport (ratio) Intensitéémission A/Intensitéémission D. Le ratio est le plus élevé en situation de FRET, le plus faible quand le FRET est perdu (A et D séparés).

FRET et ratio IA/ID

2.4 FRET et mesure de durée de vie de fluorescence

quand un fluorophore a été excité (l'excitation demande environ 10-15 s), il se relâche vers l'état excité de plus bas niveau avec production de chaleur en 10-14 à -11 s, puis il demeure excité de l'ordre de 10-9 à -8 s (1 à 10 ns) avant la retombée à l'état fondamental avec émission de fluorescence. Comme pour un phénomène de décroissance radioactive, on est face à un phénomène statistique et on va pouvoir mesurer la constante de temps de la décroissance exponentielle de l'état excité ou la demi-vie de l'état excité du fluorophore. Le phénomène de FRET accroît la probabilité de retour du donneur à son état fondamental : la vie à l'état excitée est raccourcie. Des excitations conduites à l'aide de pulses LASER et associées à des détecteurs à haute résolution temporelle permettent d'évaluer ce phénomène (on travaille à la ns !!).

Soit ΤD/D la durée de vie de D excité isolé et ΤD/D-A la durée de vie de D excité en FRET avec A, on peut écrire la formule d'efficacité ci-dessous :

$$E_{FRET}=1-{\frac{T_{D/A-D}}{T_{D/D}}}$$

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