1. Echantillon de volume V, de concentration C_x. Soit n _x la quantité de X :
   
   n_x = C_x * V

2. On ajoute un volume V_i d'étalon interne i contenant n_i moles de i. Les concentrations respectives en X et en i deviennent alors C_1x et C_1i.

3. Le prétraitement conduit à récupérer un volume V₂ contenant n_2x et n_2i moles de X et de i. Les concentrations respectives en X et en i deviennent alors C_ax et C_ai.

4. Si on appelle respectivement r_x et r_i les rendements du prétraitement pour X et i ; on a :
   
   n_2x = r_x * n_x
   
   et
   n_2i = r_i * n_i

5. On suppose que l'appareil analyse sur un volume V_a (volume "injecté") et mesure ainsi les quantités n_ax et n_ai qui répondent à :
   
   n_ax = C_ax * V_a
   
   et
   n_ai = C_ai * V_a
   

6. On suppose une mesure quantitative avec des signaux respectifs S_x et S_i pour X et i et des facteurs de réponse k_x et k_i qui obéissent à :
   
   n_ax = k_x * f_x * S_x
   
   et
   n_ai = k_i * f_i * S_i.
   
   où f_x et f_i représentent le facteur de dérive/fluctuation du coefficient de réponse à un instant donné sur la mesure de x et i respectivement.

On va maintenant établir les 2 relations n_x = f(S_x) et n_i = f(S_i).

On va voir qu'elles font intervenir r_x, V₂, V_a, k_x, f_x et r_i, V₂, V_a, k_i, f_i respectivement.

Et ceci nous permettra de démontrer que l'étalon interne joue le rôle "d'espion" :
- c'est lui qui "fournit" les valeurs de V₂, V_a ;
- et c'est lui qui permet de s'affranchir des variations sur r_x, k_x et f_x lors de chaque mesurage à la condition que r_i, k_i et f_i subissent les mêmes variations relatives pour le même mesurage.

"Démonstration".

Rappel des étapes en cause.

On reprend, par la fin, le schéma du tableau présenté ci-dessus.

Rappel des égalités vues dans le tableau ci-dessus.

On a supposé des réponses proportionnelles aux quantités injectées mesurées avec fluctuations de réponses (6), soit :
n_ax = k_x * f_x * S_x

et
n_ai = k_i * f_i * S_i

Donc en "injectant" les relations données dans (5), on obtient :
C_ax * V_a = k_x * f_x * S_x

C_ai * V_a = k_i * f_i * S_i

Or on a C_ax = n_2x / V₂
et
C_ai = n_2i / V₂   (d'après (3))

donc on peut écrire :
(n_2x / V₂) * V_a = k_x * f_x * S_x

et
(n_2i / V₂) * V_a = k_i * f_i * S_i

Utilisons alors les relations liées aux rendements du prétraitement pour X et i données par (4), on arrive à :

(n_x * r_x / V₂) * V_a = k_x * f_x * S_x

et
(n_i * r_i / V₂) * V_a = k_i * f_i * S_i

On peut donc écrire - au choix -la relation fondamentale :

(n_x / n_i) = (r_i / r_x) * (k_x / k_i) * (f_x / f_i) * (S_x / S_i)

ou

(C_1x / C_1i) = (r_i / r_x) * (k_x / k_i) * (f_x / f_i) * (S_x / S_i)

Posons alors quelques remarques :
- le volume "injecté" V_a n'apparait plus, il n'a pas à être déterminé pour chaque mesure ponctuelle. Il est le même pour l'étalon externe et interne pour chaque mesure ponctuelle et cela suffit à notre affaire.
- ( k_x / k_i ) est un rapport constant pour l'analyte X à doser et l'étalon interne I valable pour une série de mesures.
- La plupart des appareils de mesures permettant de mettre en oeuvre l'étalonnage avec étalon interne ont un principe de construction qui engendre f_x = f_i à tout instant et donc f_x / f_i = 1 à tout instant .
- Les protocoles d'extraction-préparation des échantillons sont incapables de permettre de maitriser les valeurs de r_x et r_i mais il est assez simple de les concevoir de telle sorte que r_i / r_x = 1 .

Conclusion :
Grâce à l'étalon interne, à qui il arrive ce qu'il arrive à l'analyte à doser, on obtient une relation simple qui permet de "contourner" astucieusement tous les "inconnus" du problème :

(n_x / n_i) = * ( k_x / k_i ) (S_x / S_i)   (relation (F1))

ou

(C_1x / C_1i) = * ( k_x / k_i ) (S_x / S_i)   (relation (F2))

avec ( k_x / k_i ) coefficient caractéristique parfaitement constant dans une série de mesures. ( k_x / k_i ) sera connu très facilement par la mise en oeuvre d'un étalonnage avec des solutions contenant X et I en quantités connues.

Ainsi se termine le traitement du "cas général". Mais pour rester concret appliquons le aux 3 cas évoqués précédemment...

Les résultats obtenus avec le mélange des 2 étalons adrénaline et DHBA

Les résultats de Monsieur Dupont

Les résultats de Madame Durand

3 pg d'adrénaline et 5 pg de DHBA conduisent à des pics de surfaces respectives 230673 et 557 219 unités.

Un volume essai E de 1,00 mL de plasma auquel on ajoute 50 µL d'une solution de DHBA qui apportent ainsi 500 pg de DHBA conduisent à un pic adrénaline de surface 96 620 unités et un pic DHBA de surface 429 766 unités.

Un volume essai E de 1,00 mL de plasma auquel on ajoute 50 µL d'une solution de DHBA qui apportent ainsi 500 pg de DHBA conduisent à un pic adrénaline de surface 174532 unités et un pic DHBA de surface 397 562 unités.

On applique la relation (F1) sans sourciller, presque sans réfléchir au problème, et on obtient instantanément :

3 / 5 = (k_x / k_i) * (230673 / 557219)
soit
(k_x / k_i) = (3 / 5) * (557219 / 230673)

n_x / 500 = (k_x / k_i) * (96620 / 429766)
soit
n_x = (k_x / k_i) * (96620 / 429766) * 500

n_x / 500 = (k_x / k_i) * (174532 / 397562)
soit
n_x = (k_x / k_i) * (174532 / 397562) * 500

D'où :

n_x = (3 / 5) * (557219 / 230673) * (96620 / 429766) * 500
qui donne
n_x = 163 pg ; et ce dans 1,00 mL de plasma ...

n_x = (3 / 5) * (557219 / 230673) * (174532 / 397562) * 500
qui donne
n_x = 318 pg ; et ce dans 1,00 mL de plasma ...