Etalonnages avec étalon interne

1. Etude de cas n°1 (dosage HPLC après traitement préliminaire)
Dosage d'adrénaline plasmatique

1.1 Présentation du dosage de l'adrénaline plasmatique par HPLC

Il s'agit du dosage de l'hormone adrénaline dans le plasma sanguin. L'adrénaline est mesurée grâce à une chromatographie liquide haute performance mettant en oeuvre une phase stationnaire apolaire. Le détecteur en ligne est un détecteur électrochimique ampérométrique. Le plasma ne peut être analysé directement, une extraction-purification préalable partiellement sélective est nécessaire. La sélectivité du dosage pour l'adrénaline est la résultante du trinôme "sélectivité partielle du pré-traitement /temps de rétention caractéristique/détection électrochimique caractéristique".

1.2 Le traitement préalable des plasmas à mesurer

on utilise le fait que les hormones catécholamines sont fortement adsorbées par l'alumine.

A un volume essai E de 1,00 mL de plasma on ajoute 50 µL d'une solution de DHBA qui apportent ainsi 500 pg de DHBA. La DHBA est la 3,4-dihydroxybenzylamine. Elle est naturellemnt absente des plasmas sanguins, elle est utilisée comme 'traceur' de l'étape de traitement préalable de l'échantillon. A l'analyse HPLC, elle est détectée et donne un pic bien différencié de celui de l'adrénaline. La DHBA est l'étalon interne de cette analyse, la quantité ajoutée à l'essai est exactement connue.
On met le mélange en contact avec une charge de quelques dizaines de µL de poudre d'alumine qui adsorbe (entre autres) l'adrénaline et la DHBA. On agite, on élimine l'éluat.
On lave à l'aide d'un tampon de lavage (2 fois 1 mL). L'adrénaline et la DHBA (entre autres) demeurent adsorbées.
On désorbe à l'aide d'un tampon de désorption (120 µL) : On ajoute le tampon; on ferme; on agite; on récupère l'éluat qui contient l'adrénaline et la DHBA (partiellement purifiées).

1.3 L'analyse chromatographique HPLC

• Les volumes injectés sont de 20 µL. Avec la colonne et la phase mobile utilisées, au débit de 1 mL/min, l'adrénaline élue à 6 min et la DHBA à 8,5 min.

• Un étalonnage préalable dit "externe" est réalisé avec un mélange contenant 3 pg d'adrénaline par µL et 5 pg de DHBA par µL. 20 µL de ce mélange sont directement injectés pour analyse HPLC sans subir la phase d'adsorption-élution sur colonne d'alumine.
Ainsi on étalonne avec respectivement q_et,adr = 60 pg et q_et,dhba = 100 pg d'adrénaline et de DHBA injectés.

On obtient un pic étalon adrénaline de surface S_et,adr = 230673 unités.

Et un pic étalon DHBA de surface S_et,dhba = 557219 unités.

• On peut alors doser les essais issus de plasmas "prétraités" de différents patients. Voici 2 exemples de résultats :

Pour M. Dupont	Pour Mme Durand
L'éluat de désorption de la phase de traitement préalable est analysé. On obtient : Un pic adrénaline de surface S_a = 96620 unités. Et un pic DHBA de surface S_i = 429766 unités.	L'éluat de désorption de la phase de traitement préalable est analysé. On obtient : Un pic adrénaline de surface S_a = 174532 unités. Et un pic DHBA de surface S_i = 397562 unités.

1.4 Calcul de la concentration en adrénaline des plasmas dosés (méthode pas à pas)

On peut calculer facilement la quantité d'étalon interne DHBA (q_i) et d'adrénaline (q_a) qui ont été analysées lors de la mesure de chaque essai. Dans les 20 µL injectés !!
Pour M. Dupont	Pour Mme Durand
On a q_a / q_et,adr = S_a / S_et,adr Et on a q_i / q_et,dhba = S_i / S_et,dhba En effet, la surface d'un pic est proportionnelle à la quantité de matière qui l' a déclenché.
Le calcul donne q_a = (96620 / 230672) * 60 = 25,13 pg. Le calcul donne q_i = (429766 / 557219) * 100 = 77,13 pg. Cela signifie que sur 500 pg de DHBA qu'on avait introduit dans l'échantillon à doser, on en retrouve 77,13 pg dans les 20 µL d'éluat de désorption analysés. Ceci conduit à un facteur f de récupération de l'étalon interne dans 20 µL. f est égal à 77,13 / 500 pour l'analyse de ce plasma.	Le calcul donne q_a = (174532 / 230672) * 60 = 45,40 pg. Le calcul donne q_i = (397562 / 557219) * 100 = 71,35 pg. Cela signifie que sur 500 pg de DHBA qu'on avait introduit dans l'échantillon à doser, on en retrouve 71,35 pg dans les 20 µL d'éluat de désorption analysés. Ceci conduit à un facteur f de récupération de l'étalon interne dans 20 µL. f est égal à 71,35 / 500 pour l'analyse de ce plasma.
Evidemment f varie pour chaque analyse. Si on peut connaître f, c'est grâce à l"espion" étalon interne.

Si on prétend que le DHBA se comporte comme l'adrénaline lors du traitement préalable, on peut appliquer le facteur f à l'adrénaline.
Pour M. Dupont (f=77,13 / 500 = 0,15426)	Pour Mme Durand (f=71,35 / 500 = 0,14270)
Il y avait donc 25,13 / f = 162,9 pg d'adrénaline dans l'échantillon de départ qui avait été constitué avec 1 mL de plasma. Donc, pour le plasma analysé : [adrénaline]_Dupont = 163 pg /mL.	Il y avait donc 45,40 / f = 318,1 pg d'adrénaline dans l'échantillon de départ qui avait été constitué avec 1 mL de plasma. Donc, pour le plasma analysé : [adrénaline]_Durand = 318 pg /mL.

1.5 Conclusion

On voit l'intérêt de l'étalon interne dans ce dosage :
On ne connait pas le rendement exact de récupération de l'adrénaline du plasma dans le volume injecté pour l'analyse HPLC. C'est l'étalon interne qui nous renseigne à chaque analyse. La condition de validité est évidemment que l'étalon interne se comporte comme la substance à doser lors du traitement préalable.

Voyez aussi absolument comment calculer l'exemple ci-dessus de façon plus générale et plus formelle en lisant le paragraphe "Etude Générale".
L'application de l'étude générale donne immédiatement :

Les résultats obtenus avec le mélange des 2 étalons adrénaline et DHBA	Les résultats de Monsieur Dupont	Les résultats de Madame Durand
3 pg d'adrénaline et 5 pg de DHBA conduisent à des pics de surfaces respectives 230673 et 557 219 unités.	Un volume essai E de 1,00 mL de plasma auquel on ajoute 50 µL d'une solution de DHBA qui apportent ainsi 500 pg de DHBA conduisent à un pic adrénaline de surface 96 620 unités et un pic DHBA de surface 429 766 unités.	Un volume essai E de 1,00 mL de plasma auquel on ajoute 50 µL d'une solution de DHBA qui apportent ainsi 500 pg de DHBA conduisent à un pic adrénaline de surface 174532 unités et un pic DHBA de surface 397 562 unités.
On applique la relation F1 du §4 sans sourciller, presque sans réfléchir au problème, et on obtient instantanément :
3 / 5 = (k_x / k_i) * (230673 / 557219) soit (k_x / k_i) = (3 / 5) * (557219 / 230673)	n_x / 500 = (k_x / k_i) * (96620 / 429766) soit n_x = (k_x / k_i) * (96620 / 429766) * 500	n_x / 500 = (k_x / k_i) * (174532 / 397562) soit n_x = (k_x / k_i) * (174532 / 397562) * 500
D'où :	n_x = (3 / 5) * (557219 / 230673) * (96620 / 429766) * 500 qui donne n_x = 163 pg ; et ce dans 1,00 mL de plasma ...	n_x = (3 / 5) * (557219 / 230673) * (174532 / 397562) * 500 qui donne n_x = 318 pg ; et ce dans 1,00 mL de plasma ...

1.6 Bibliographie

Goldstein et al, Man, Life Sci. 28:467(1981)
Hjemdahl et al, Acta Physiol. Scand. Suppl. 527:43-57 (1984)
Documentation technique Recipe Chemical and Instruments (München)