Les étapes de purification vont faire appel à des techniques chromatographiques : (bio)affinité (AC), échange d'ions (IEXC), interaction hydrophobe (HIC), exclusion-diffusion = gel filtration (GFC). La lecture de ce paragraphe implique des connaissances de base concernant ces différentes chromatographies. Elles sont détaillées dans des paragraphes dédiés.

1. Stratégie idéale de purification

1.1 Description générale

Dans l'idéal, il s'agirait de pratiquer une chromatographie avec une phase stationnaire et des conditions de phase mobile qui retiendraient la seule protéine d'intérêt avec élution de toutes les autres protéines. Il suffit de déclencher, dans un 2° temps, la sortie de la protéine d'intérêt. Pour cela, les chromatographies d'affinité biospécifiques (AC) sont presque parfaites (pas tout à fait malheureusement, voir la suite ...).

Les étiquettes de type poly-histidinyls (his6) ou GST ajoutées en Nt ou Ct des protéines à purifier (on parle de protéines de fusion) grâce aux technologies génétiques permettent de mettre en oeuvre de façon très systématique cette "stratégie idéale". A défaut d'étiquette, la "stratégie idéale" est possible si on peut mettre en oeuvre une chromatographie d'affinité traditionnelle avec un ligand judicieux à conjuguer au support de chromatographie (voir le paragraphe dédié AC). stratégie idéale

1.2 Exemples d'étiquettes de purification

Étiquette (Tag)

Motif de liaison spécifique

Méthode d'élution de la POI étiquetée retenue

His6-étiquette (parfois jusqu'à His10)

La plus célèbre des étiquettes de purification. Petite étiquette placée en Nt ou Ct qui ne perturbe généralement quasiment pas les repliements natifs ...Utilisable pour purification de protéines non natives en corps d'inclusions. Voir paragraphe dédié complémentaire ci-après. On utilise l'acronyme IMAC, Ion Metal Affinity Chromatography.

Ni2+ chélaté (ou Cu2+)

Compétiteur imidazole (250-500 mM) ou abaissement du pH vers ~pH 5

Glutathione S-transferase (GST). Étiquette de nature protéique à 220 aminoacides ! C'est gros.

Glutathion immobilisé (GSH)

Glutathion (réduit) (10-20 mM)

Maltose-binding protein (MBP). Une grosse protéine, donc une très grosse étiquette.

Amylose

Compétiteur maltose (10 mM). C'est pas cher !

Strep-tag () / StrepII-tag

Petite étiquette assez inerte pour les repliements natifs de la protéine d'intérêt. se comporte comme de la biotine pour l'avidine. Voir https://www.iba-lifesciences.com/strep-tag.html

Strep-TactinTM (comme si de la streptavidine était immobilisée sur support pour retennir de la biotine (le Strep-tag)

Compétiteur Desthiobiotin (2.5 mM) puis régénération du support à la compétition HABA

1.3 Raffinage (polishing)

Souvent (tout dépend de l'état de pureté que l'on veut atteindre), la purification par bioaffinité devra être suivie d'un raffinage (polishing). C'est par exemple le cas si on souhaite une protéine très pure après une étape de type affinité IMAC (l'IMAC utilise l'étiquette 6-hitidinyls et la chélation sur support Ni2+ chélaté ...voir le paragraphe dédié) qui ne conduit pas à des puretés parfaites (voir paragraphe dédié).

Pour le raffinage, on met classiquement en oeuvre une chromatographie d'échange d'ions (IEXC, élution en gradient de force ionique) puis une exclusion-diffusion (GFC, gel filtration). La gel filtration est très intéressante pour séparer différentes formes oligomériques par exemple.

2. Stratégie pas par pas sans bioaffinité

Il est très classique de débuter par une étape de précipitation fractionnée, souvent au sulfate d'ammonium (pas forcément, voir le chapitre dédié) qui peut présenter l'avantage de concentrer l'échantillon protéique à purifier. Si on souhaite purifier par une IEXC à la suite, il faudra éliminer le sulfate d'ammonium. Ce ne sera pas le cas si on souhaite mettre en oeuvre une HIC.

stratégies pas par pas

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