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JF Perrin mise à jour mars 2021
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Des motifs chimiques hydrophobes phenyle, octyle, ou butyle ou methyle sont greffés sur une résine hydrophile. Les phases stationnaires pour HIC sont utilisables et utilisées avec des tampons d'élutions aqueux ce qui est évidemment très important pour travailler avec des proteines. C'est là la différence avec ce qu'on appelle la chromatographie sur phase inversée hydrophobe (reverse phase chromatography, RPC), très utilisée pour les chromatographies analytiques, et qui met en oeuvre des phase stationnaires greffées de fluides apolaires qui recouvrent la totalité de la surface et qui impliquent des élutions avec des solvants apolaires.
En HIC, une protéine sera d'autant plus retenue qu'elle propose, en surface, des motifs hydrophobes. On a expliqué dans le paragraphe 1 du chapitre "Précipitations fractionnées des protéines" ( Précipitation fractionnée des protéines au sulfate d'ammonium) que le sulfate d'ammonium en solution concentrée dans l'eau favorisait les interactions hydrophobes de surface. Ainsi, en HIC, on débute toujours par une phase mobile à haute concentration en sulfate d'ammonium (force ionique élevée) qui favorise la rétention des protéines de l'échantillon par interaction hydrophobe. On applique alors un gradient d'élution en diminuant la concentration en sulfate d'ammonium de la phase mobile (ce qui augmente son pouvoir d'élution). Les protéines vont d'autant plus facilement décrocher de la phase stationnaire qu'elles présentent une faible densité de de motifs hydrophobes de surface.
Explications surface hydrophotes/sulfate d'ammonium/ordre d'élution. Une protéine globulaire est soluble en milieu aqueux par les interactions hydrophiles de ses motifs de surface hydrophiles avec l'eau. Si on élève fortement la concentration en sel non chaotropique (en sulfate d'ammonium par exemple), l'eau disponible pour la solubilisation d'une protéine va diminuer. L'eau est est "détournée" vers la solvatation du sulfate et de l'ammonium. Et on va ainsi favoriser les interactions hydrophobes entre les zones hydrophobes de surface des protéines elles mêmes (agrégation) ou entre les zones hydrophobes de surface des protéines et toute autre surface hydrophobe. Avec un sel non chaotropique comme le sulfate d'ammonium, à basse température, les protéines demeureront à l'état natif. La physique de ce phénomène est très complexe et fait intervenir un effet entropique : lors de l'association de surfaces hydrophobes, il y a diminution des cages d'eau et donc effet entropique favorable (positif). C'est très complexe... On peut rester empirique.