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Effets réversibles et "irréversibles"

Exemple 1, pH et k₀ de la ribonucléase A

Exemple 2, pH et k₀ et K_m et k₀/K_m de l'α-chymotrypsine

pH et k₀ et K_m et k₀/K_m

Bibliographie et sitographie

JF Perrin mise à jour octobre 2016
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pH et k₀ ou K_m ou k₀/K_m

1. Effets sur k₀ et K_m

On suppose qu'on travaille dans la zone d'effets réversibles du pH (on peut dire aussi zone de stabilité au pH).

A la lumière des deux exemples vus précédemment, on voit que le pH agit en modifiant l'état de protonation de résidus aminoacyls proposant des couples acide/base et qui sont des résidus clés, limitants, pour l'acte catalytique et/ou la liaison du substrat et/ou la géométrie du site actif. Les effets se font donc ressentir sur les paramètres cinétiques k₀ et/ou K_m et k₀/K_m. Ces résidus clés limitants doivent être, selon les enzymes, soit à l'état protoné soit à l'état déprotoné pour pour l'acte catalytique et/ou la liaison du substrat et/ou la géométrie du site actif.On peut donc construire le tableau simple suivant :

Résidu(s) déterminant(s) pour l'acte catalytique Modèle simple à 1 ou 2 résidus max. limitants		Résidu(s) déterminant(s) pour l'affinité apparente pour le substrat Modèle simple à 1 ou 2 résidus max. limitants
Doit être protoné AH+	Doit être déprotoné B-	Doit être protoné AH+	Doit être déprotoné B-
k0 diminue quand pH augmente (pKa = valeur critique 50% dans le bon état).	k0 diminue quand pH diminue (pKa = valeur critique 50% dans le bon état).	Km augmente (moins d'affinité) quand pH augmente (pKa = valeur critique 50% dans le bon état).	Km augmente (moins d'affinité) quand pH diminue (pKa = valeur critique 50% dans le bon état).
Effet de cloche quand les 2 cas cohabitent.		Effet de bol quand les 2 cas cohabitent.

 

Il peut y avoir des cas d'indépendance au pH dans la zone de réversibilité, la papaine est le cas le plus cité dans les cours en lignes et les ouvrages pour étudiants. Dans la littérature que j'ai pu consulter, c'est vrai mais uniquement pour le paramètre K_m, indépendant du pH sur la zone de pH 3,7-9,3

2. Effets sur l'efficacité k₀/K_m

L'efficacité combine, pour [S] <<<K_m les effets sur k₀ et K_m. La meilleure efficacité implique un "gros k₀ et un petit K_m". Les allures générales sont en cloche. Sauf quand elles ne le sont pas ...

On rappelle qu'à concentration en substrat très petite devant le K_m, la relation de Michaelis \( v_i = k_0 [E_0] \frac {[S]}{K_m + [S]} \) devient quasi assimilable à \( v_i = \frac {k_0}{K_m} [E_0][S]] \).

Deux exemples classiques sous forme de figures ci-dessous.

k0/Km, exemple d'allure en cloche par seul effet sur k0 Exemple de la papaine D'après Lowe G, Yuthavong Y. pH-dependence and structure-activity relationships in the papain-catalysed hydrolysis of anilides. Biochemical Journal. 1971;124(1):117-122.	k0/Km, exemple d'allure en cloche par combinaison d'effets sur k0 et Km Exemple de l'α-chymotrypsine Voir les explications du paragraphe 3.
D'après l'article Le Km est indépendant du pH entre 3,7 et 9,3, la cloche est due au seul effet sur k0.

Et un exemple moins classique ci-dessous, pas d'allure en cloche.

k0/Km, exemple d'allure à 1 seule limitation par le pH (bacteriophage K1 endosialidase

(Morley, Thomas J. et al. "A New Sialidase Mechanism: BACTERIOPHAGE K1F ENDO-SIALIDASE IS AN INVERTING GLYCOSIDASE." The Journal of Biological Chemistry 284.26 (2009): 17404-17410). Enzyme = bacteriophage K1 endosialidase = endoNF ; réaction = hydrolyse du substrat (Sia3-TFMU) qui est un trimère d'acide sialique acid lié par liaison osidique à l'aglycone trifluoromethylumbelliferyl ; produit de réaction = trifluoromethylumbelliferyl libre (coumarine) qui absorbe à 380 nm. [...]The trimer (Sia3-TFMU) is cleaved exclusively at the coumarin-sialoside bond, it was chosen as the substrate for further kinetic [...] analysis by monitoring the release of free trifluoromethylumbelliferyl. [...] Kinetic analyses were performed at pH 4.5 (20 mm sodium phosphate/citrate buffer, 50 mm NaCl), monitoring the release of the free coumarin at 380 nm (ε = 1580 m-1 cm-1) using a Varian Cary-4000 UV-visible spectrophotometer. [...] Enzyme stability assays were conducted by preincubation of aliquots of EndoNF with the desired buffer (20 mm with 50 mm NaCl) for 30 min at 37 °C before being assayed (at pH 4.5) and compared against a standard incubated at pH 7.5 (20 mm Tris-HCl, 50 mm NaCl) for the same period.

3. pK des résidus aminoacyls dans les sites actifs

Attention, les pK des résidus amminoacyls présentant des fonctions acide/base peuvent être très différents des valeurs usuelles en solutions aqueuse du fait des environnement très spéciaux qui règnent dans les sites actifs !

Ainsi le noyau imidazol de l'histidine qui a un pK dans l'eau vers 4 est trouvé à pK depuis 6 à 8,5 dans les enzymes. Les fonctions carboxyliques en γ et β des résidus glutamate et aspartate de pK vers 4 dans l'eau peuvent avoir des pK entre 7 et 1 dans des sites actifs. Le -SH de la cystéine peut exprimer une acidité conséquente dans certains sites ...

4. Calculs plus ou moins complexes, modèles à plus de 2 résidus limitants

Les modèles à 2 limitants sont du type "maillon faible", on s'intéresse en fait à chaque extrémité de pH, au premier "qui casse". On peut évidemment se livrer à des modélisations plus ou moins complexes intégrant les pK de plus de 2 résidus dont certains de pK très proches dont l'état de protonation importe...

Pour ceux qui adorent les calculs, un lien hommage vers un scan pdf de quelques pages du "polycopié de l'Université Paris VII, "Enzymologie, Cinétique", Licence de Biochimie, de Burstein, Chambert, Gonzy-Treboul, Guion-Rain, Orsini et Reboud, édition année universitaire 1980-1981 (publié pour le public étudiant de l'époque). Détermination des pKa de résidus aminoacyls déterminants pour k₀ et K_m à l'aide de l'étude expérimentale des paramètres cinétiques en fonction du pH.